概要

• 市場第一台一站式多參數生物製劑穩定性篩選平台

Uncle 結合了三種不同的測量模式—全光譜差示掃描螢光（differential scanning fluorimetry，DSF）、靜態散射光（SLS）和動態散射光（DLS）。因此您可以使用更少的蛋白質在短短幾小時內獲得所有數據。你獲得的所有資訊將使選擇最佳的配方、蛋白質或病毒載體變得輕而易舉。

• 使用獨特的”Uni”微量石英Cuvette

使用極少量的樣品獲得更多數據。Uni 只需要 9 μL樣本，即可確保樣本於高效溫度傳導與氣密封閉狀態下進行多參數量測，非常適合進行長時間與高溫穩定性試驗，譬如可進行一個為期三天的DLS實驗以監測樣本即時穩定性。

偵測技術

• 全光譜差式掃描螢光（differential scanning fluorimetry，DSF）
• 加速穩定度分析

利用差異掃描螢光法（DSF），你可以迅速篩選出多種蛋白質或配方，找到最穩定的選項。與其等待數天或數周進行高溫等溫加速實驗，甚至更長時間的實時穩定性研究，DSF 只需幾小時即可通過評估蛋白質在溫度變化過程中的結構變化來提供結果。

• 全光譜設計用以充分利用螢光

DSF 偵測原理是通過測量蛋白質結構變化時的螢光訊號變化來完成。而螢光訊號可以來自蛋白質自身的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基（內源螢光），也可以來自添加的螢光染料，如 SYPRO® Orange。

• 觀察光譜波形改變

對於蛋白質來說，發射螢光訊號的光譜波形取決於螢光氨基酸周圍的局部環境。折疊蛋白質具有高度非極性疏水口袋，其螢光光譜與螢光氨基（Trp, Tyr, Phe）酸暴露在弱極性的水環境中的展開蛋白質的光譜會有所不同。

• 使用加熱系統

差示掃描螢光法（DSF）中的“差異”來自於加熱。透過 DSF，可以測量蛋白質在熱梯度下展開時螢光的變化。

• 識別拐點

起始溫度（T_onset）是蛋白質開始展開的溫度。其他拐點（T_m1、T_m2）是展開過程中點的溫度。靜態光散射（SLS）可以識別聚集溫度（T_agg），這是當蛋白質展開時導致蛋白質聚集時的溫度。

• 透過全光譜螢光檢測獲取更多資訊

全譜螢光不僅僅是擁有最佳的信噪比：它是發現 DSF 實驗出錯的關鍵工具，也是備用計劃的重要部分。某些較小的蛋白質可能不含螢光氨基酸，緩衝液也可能會發出螢光或淬滅內源蛋白質螢光的信號——這些問題都可以通過全譜檢測來解決。

DSF 可以使用追踪蛋白質展開的螢光訊號來進行，這是只有能檢測該信號的系統才能使用的選項。或者對於病毒載體的穩定性研究，可以使用對核酸敏感的染料，如AAV等病毒載體，來檢測基因組何時開始從病毒外殼中洩漏。

• 靜態光散射（SLS）
• 光學測量更多信息

靜態光散射（SLS）看起來似乎很簡單——激發光進入樣品，撞擊粒子，然後反射出來——但實際上，靜態光散射是檢測溶液中粒子的最強大技術之一。反射光的強度是SLS實驗的主要讀值，如果你知道你的樣品內容物，訊號強度能告訴你很多信息。SLS可用於計算病毒顆粒的滴度，或者作為最敏感的方法來監測樣品開始聚集的時間。

• 靜態光散射如何運作？

使用 SLS 時，激發光光束被引導至樣品，並在樣品周圍的一個或多個角度測量散射光。散射光的強度會受到多種樣品和設置屬性的影響，例如：

• 粒子分子量
• 粒子尺寸（R_g）
• 粒子濃度
• 粒子之間的相互作用力
• 粒子和溶劑的折射率
• 激發光與偵測器之間的角度
• 激發光波長

我們可以利用測量到的強度來表示樣品中的粒子特性。運作方式如下：

• 照射合適的光

相對於光波長較小的粒子將均勻地向所有方向散射光（瑞利散射）。對於紫外和可見激光，蛋白質和腺相關病毒（AAV）等生物製劑被認為是小粒子。

• 測量強度

散射光的強度將取決於與樣品、光源和偵測設置相關的多種因素。對於小且稀釋的粒子，強度與以下因素成正比：

粒子分子量（M）

粒子濃度（C）

緩衝液的折射率（n_o）

粒子相對於濃度的折射率差異（dn/dc）²

• 提高溫度

通過靜態光散射和熱階梯，你可以測量聚集溫度（T_agg）——即 SLS 強度開始增加並且聚集失控的溫度。

• 搭配其他技術進一步得到雙重效益

通過同時進行 SLS 和 DLS偵測，你可以確定來自 AAV 外殼的散射光強度。這使你可輕鬆快速獲得 AAV 得效價資訊。

• 靜態光散射與動態光散射——有什麼區別？

儀器通常同時提供靜態光散射（SLS）和動態光散射（DLS）數據，因此你可能會想知道這些技術之間的區別以及什麼時候使用哪一種。SLS 主要關注平均強度，可以告訴我們在某些設置中粒子的分子量和濃度。相比之下，DLS 讀取散射光強度隨時間的變化速度，這提供了擴散率和粒子大小的信息。可以這麼說，這就像聽搖滾音樂會——SLS 會告訴你音樂有多響，而 DLS 會告訴你正在播放哪首歌。

所以當你考慮選擇哪種光散射時，SLS 是檢測聚集開始時的理想選擇，因為它是一種直接測量，分子量增加時強度會立即增加。相比之下，DLS 根據溶液中粒子的擴散來觀察粒子大小，因此 DLS 需要一些時間來檢測運動的粒子。

但從好的一面來看，當你對樣品了解較少時，DLS 更具定量性，因此它非常適合於日常或批次間比較粒子大小，以及在長時間等溫實驗中測量粒子大小的變化。

• 動態光散射（DLS）
• 為生物製劑研究人員提供設計用於生物製劑的動態光散射儀器

動態光散射（DLS）通過測量分子或粒子在溶液中散射的激發光光強度的快速變化來確定大小和分佈。DLS 分析是一種快速、無標記、非破壞性的方式來了解許多生物製劑的大小——胜肽、蛋白質、病毒或類病毒顆粒（VLP）。對於測量10 nm抗體、30 nm AAV或任何亞微米蛋白樣品的平均大小和聚集狀態，DLS 是生物製劑研究人員的最佳選擇。而旋轉角動態光散射（RADLS）是一種更強大的技術，它基於DLS的基本原理，從多個角度收集數據。

• Unchained Labs 擁有解決問題的頂級 DLS 儀器——Stunner 和 Uncle。這兩者都僅需極少量樣品，而每台儀器都有一些額外功能：想快速讀取濃度和大小？只有 Stunner 能做到。想全面了解樣品的穩定性？Uncle 是你的全方位平台。
• 動態光散射如何運作？

將激發光照射到粒子溶液上，你會得到大量的光散射回來。當激發光波長遠大於粒子時，每個方向的光散射量相等——這就是為什麼我們在 DLS 儀器中使用 660 nm 激光的原因。

DLS 可以通過測量散射光隨時間變化的速度來告訴你很多關於溶液中粒子大小的信息（圖1）。由於小粒子快速移動，光強度變化也很快。相反，較大的粒子因為移動較慢，光強度變化較慢。分析光強度變化的速度——這就是 DLS 分析的關鍵。

（圖 1. 不同尺寸顆粒的光散射強度隨時間變化不同。）

以下是分析 DLS 光散射數據的方法：選擇一個時間點——現在向前跳一微秒。大多數粒子可能還沒有移動，所以光散射沒有變化，零時間點和一微秒後的數據差不多。換句話說，它們有很高的相關性。現在不是一微秒，而是向前跳一整秒。大多數粒子將處於完全不同的位置——你現在的數據與一秒後的數據完全無關。將這些不同時間跨度的相關值繪製成圖，你就得到了一個相關函數（圖2）。粒子從高相關性變為零相關性的速度告訴你它們的平均大小。這也是為什麼動態光散射有時被稱為光子相關光譜（PCS，photon correlation spectroscopy）。

（圖 2. 兩種不同大小蛋白質的相關函數。）

要從相關函數獲得你真正關心的數據——粒子直徑，使用了兩種分析方法。第一種方法會利用相關函數 (Correlation Function) 處理因粒子布朗運動造成的散射光強度變化，進一步求出待測粒子之擴散係數 (Diffusion Coefficient)，再帶入斯托克斯-愛因斯坦方程（Stokes-Einstein）。

為了完成這個方程中的其他變量，樣品溫度會被測量，粘度則由用戶定義。計算出的直徑是水合直徑（hydrodynamic diameter）。擴散係數測量的標準偏差與大小分佈的寬度相關，通常會轉換為多分散性指數（PDI）。

第二種 DLS 分析方法利用 DLS 數據庫來重現測量數據並確定樣品的大小分佈（圖3）。這兩種分析方法都遵循最新的 ISO 標準進行 DLS 粒度分析，即 ISO 22412:2017。

(圖3)

在生物製劑領域，動態光散射不僅能告訴你樣品的大小，還能快速檢查樣品是否聚集。由於大粒子會強烈地散射光線，DLS 可以檢測到樣品中即使非常稀有的聚集體。對蛋白聚集體發出警告，避免你依賴已經過最佳狀態的樣品數據，或者解釋為什麼你的抗體不再有好的表現。

• Unchained Labs 所有的動態光散射儀器均提供以下特點：
• 每個樣本在不到一分鐘的時間內即可提供準確、可重複和具再現性的尺寸數據
• 使用小樣品體積和低濃度的最佳組合樣本即可獲取數據
• 提供整個樣品平均直徑結果
• 當有多個峰值時，提供大小分佈資訊
• 即使對於傳統 SEC 分析來說可能太大或太稀有的聚集體樣本，DLS仍具有高度敏感的偵測結果
• 測量範圍從3 到 1000 納米
• 對於溶菌酶，可達到1 mg/mL 的濃度，對於較大的蛋白質，可以達到更低的濃度

測量參數

• Uncle僅需9 μL樣本即可獲得下列資訊：
• T_m & T_agg
• T_m with SYPRO (DSF)
• Isothermal stability
• Sizing & polydispersity
• Sizing with thermal ramp
• Thermal recovery
• Viscosity
• k_D/B₂₂
• G₂₂
• ΔG
• Viral capsid stability

儀器特點

• 一次性獲得更多資訊

嘗試找尋新的配方或結構結構時，Uncle可在不到2小時內對多達48個樣本進行蛋白質穩定性測量並獲得結果。同時可取得 T_m 和 T_agg，並得知蛋白質樣本何時展開導致聚集。在進行溫度梯度加熱之前量測 DLS 數值，以了解是否從一開始就存在聚集問題。

• 對樣本進行煨煮

通過進行等溫蛋白穩定性測量（ isothermal protein stability measurements），解決長期儲存測試問題。Uncle 特別為蛋白質、報導染劑或載體配備了一套量身定制的應用程序，可有效地在靜態溫度（static temperature）下煨煮樣本。利用 Uncle 預設的等溫應用程式，僅需將樣品裝入 Unis，放入培養箱中，然後將它們放回 Uncle，即可得知哪個樣本的表現出了問題，讓實驗室人員有更多時間處理其他事務。

• AAV穩定性

Uncle 搭配 SYBR Gold使用，幫助您了解 DNA 開始泄漏（leakage）的時機——在 AAV 外殼爆裂之前。量化初始的游離 DNA，以及在熱梯度後游離DNA的數量。了解何時聚集失控，並使用 SLS 和 DLS 解決粒子濃度的問題。

• 發現基因組越獄

確保 DNA 或 RNA 不會悄悄地從您的載體中逃逸。Uncle 的全光譜螢光和 SYBR Gold 及等溫應用程式，讓您可以在早期對小體積樣本進行加速、等溫的儲存測試。

• B₂₂ & k_D

在同一個 Uni中同時獲取 B₂₂ 和 k_D。如果您使用的是超高濃度樣本，則可以切換到 G₂₂。使用方便的軟體即時了解您的蛋白質配方組合是否合適，或者是否存在聚集風險。

• 釋放 Uni 的潛力

使用更少的樣品獲得更多數據。Uni 只需要 9 μL，您可以自由選擇如何使用它。早上測一個樣品，下午測 48 個樣品。如果只需要 DLS 數值，那就進行 DLS 量測。或者先進行 DLS 量測，然後再開始一個為期三天的實驗來監測樣本即時穩定性。樣品維持在密封狀態，因此可以進行短期或長期的測量。

• 全光譜

生物製劑和基因載體是特殊的。使用 Uncle，您可以獲得全螢光光譜資訊，因此您不需要提前知道樣品的行為。如果您想要嘗試一些新的染劑，Uncle 也可以識別它們。Uncle 的 SLS 使用兩個波長來檢測樣本聚集，因此在發現各種尺寸範圍內的聚集體時非常靈敏，非常適合。

• 21CFRp11

如果您在受管制的環境中工作，控制數據存取並保持其完整性是必不可少的。Uncle 具有符合 21CFRp11 規範的軟體及可提供IOQ文件，以符合各大生物製劑廠法規需求。

Uncle is a one-stop platform for protein stability that uses three detection methods: full-spectrum fluorescence, static light scattering (SLS), and dynamic light scattering (DLS) to fully profile protein stability (Figure 1). Temperature control (15–95 °C) and sealed sample chambers provide greater flexibility in how that profiling can be performed. Multiple measurements such as fluorescence, aggregation, sizing, and polydispersity can be performed in just one experiment, allowing you to obtain orthogonal information on protein stability on the same sample. Samples are loaded into low volume, multi-well quartz cuvette chambers requiring only 9 µL of sample.