什麼是Opal?

Opal 是一種多重螢光組織染色法，可在同一個組織片染最多8個biomarker及DAPI螢光，利用tyramide signal amplification (TSA)技術偵測biomarker並放大訊號10-100倍。

在空間生物學中，Opal 多重螢光染色被廣泛用於偵測co-localization或低表現的biomarkers。Opal多色螢光可結合ultrahigh-plex spatial phenotyping 組織內涵資訊，透過通量化實驗在轉譯科學領域中提供具統計意義的數據。另可搭配多光譜組織影像分析系統，提高信噪比 (扣除背景自發性螢光) 進行更精準的定量分析。

(Opal 8-plex螢光影像)

使用Opal的優勢

• 儘管選擇最適合的初級抗體，不需在意物種重複。
• 訊號放大10-100倍，超高偵測靈敏度。
• 節省抗體的用量。
• 單片組織可染最多8個biomaker螢光。
• 搭配Akoya切片掃描儀器的多光譜影像，迅速去除組織自體螢光。

（左：標準免疫螢光偵測; 右：Opal 染色TSA放大偵測）

Opal多重螢光染色原理與步驟

Opal放大訊號的原理

與傳統免疫螢光染色不同，Opal允許使用任何標準的未標記初級抗體，包括同一物種的抗體。當Opal螢光分子（tyramide molecule）被二級抗體上的HRP催化，TSA分子會聚集在抗原周圍並形成共價鍵結。

1. 一級抗體與二級HRP抗體已結合在抗原，當Opal染劑的TSA分子碰到HRP即發生反應產生自由基。

2. 自由基在抗原結合位周圍與酪氨酸行成共價鍵結。

3. 反應結束後完成訊號放大

Opal多重螢光染色步驟

Opal 螢光染色流程與標準IHC染色流程相似，製備好組織片後先進行antigen retrieval揭露抗原部位、blocking、一級抗體反應、HRP二級抗體反應、Opal螢光試劑反應放大訊號、微波爐加熱去除抗體，接續blocking的步驟開始循環，直到所有opal螢光染色結束，即可染上DAPI進行封片。

（Opal multiplex IHC 循環染色步驟）

應用範例

腦瘤微環境

Opal七色IHC螢光套組檢驗mamma carcinoma brain metastasis樣本，標定marker包含tumor marker Her-2、T cell marker CD3及CD8、myeloid cell marker Iba-1 及CD163、endothelial cell marker von Willebrandt factor。

免疫療法預測

(Opal的PhenoCode Signature Panels系列與DAB IHC在肺癌組織的染色比較)

在肺癌組織分析TAM Polarization及PD-1/PD-L1 Immune Checkpoint- 以M1/M2 Polarization phenocode signature套組染色，並以CD68, CD163及PD-L1表現作為細胞表型分析。(點此連結查看發表的相關文獻：https://www.akoyabio.com/publication/)

試劑資訊

Opal 6-Plex (MoTIF) 包含Opal 480, Opal 520, Opal 570, Opal 620, Opal 690 及 Opal 780

Opal 6-Plex 包含Opal 520, Opal 540, Opal 570, Opal 620, Opal 650 及 Opal 690

Opal 3-Plex 包含Opal 520, Opal 570 及 Opal 690

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Opal allows for the use of any standard unlabeled primary antibody, including multiple antibodies raised in the same species. The Opal polymer HRP is applied after, using Tyramide Signal Amplification (TSA) to amplify IHC detection by covalently depositing fluorescent molecules in close vicinity to that targeted antigen. After labeling is complete, antibodies are removed in a manner that does not disrupt the Opal fluorescence signal, allowing for the next target to be detected without antibody cross reactivity. Opal enables development of multiplexed assays with balanced, quantitative signal for both rare and abundant targets of interest.